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PCR克隆引物设计方法

PCR克隆是一种放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术,在分子生物学江苏快3刘军在线计划和相关领域得到广泛应用。其中PCR克隆引物是PCR扩增反应过程中重要的影响因素。因此,在正式开始PCR克隆实验之前,掌握正确的PCR克隆引物设计方法是一项必要的技能。

PCR克隆引物设计流程:

  1. 获取PCR扩增片段序列:第一种情况根据已知片段进行扩增,需要通过NCBI查找基因序列设计PCR扩增引物;另外一种情况是扩增未知基因片段,则需要查找相关物种的保守序列,根据保守序列的DNA或者RNA为模板设计引物。
  2. PCR克隆引物设计:引物设计可以通过引物设计软件或者在线工具来完成。例如Primer premier 5.0引物设计软件功能强且使用方便,可以对引物的特异性进行比对并进行综合评价,是引物设计最常用的软件之一。
  3. PCR扩增试验验证:引物合成完成之后可进行PCR扩增,根据凝胶电泳扩增产物长度预判PCR克隆引物的正确性。

PCR克隆引物设计注意事项:

  1. 引物长度基本保持在18-24bp之间。如果引物序列长度过短,那么可能扩增特异性较低,影响PCR克隆扩增速率;如果引物长度过长,不仅无法提高引物特异性,反而会因为过长的序列造成错配,降低PCR克隆扩增速率。
  2. 引物中的GC含量会影响到PCR克隆过程中寡核苷酸的解链温度,即Tm值。Tm值55-80℃为宜,上下游引物间退火温度差异在10℃之内为宜。所以,通常引物中GC含量在40%-60%之间,上下游引物间的GC含量差异在20%之内,可以提高引物的特异性。
  3. 避免引物序列中出现重复结构域或与模板序列有较高的相似度。如果出现这种情况,在PCR克隆的过程中可能会造成错配现象的出现,影响PCR扩增的准确性。
  4. 避免扩增引物的单链在PCR克隆过程中形成二级结构,抑制PCR扩增过程。

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