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分子生物学—克隆

分子克隆技术又叫DNA体外重组技术,该技术基于分子生物学水平,以人工的方法将目的基因,在体外与载体DNA分子重组,然后将重组子转入受体细胞,筛选表达重组DNA的细胞,再经过纯化、扩增,这一过程称为分子克隆技术。

  1. 分离出要克隆的目的基因及载体:
  2. (1)直接分离,适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病毒DNA的提取分离。
    (2)人工合成,序列明确的短DNA片段,可用DNA合成仪合成。
    (3)由mRNA逆转录合成cDNA
    (4)从基因组文库中筛选目的基因用于克隆
    理想的质粒克隆载体: 能在宿主细胞中独立复制,并能携DNA片段一同扩增,具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点(MCS, multiple cloning sites),可插入较大的外源DNA而不影响复制,易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。

  3. 用限制性内切酶切割目的基因和载体,使其产生便于连接的末端。
  4. 将切割后的目的基因和载体用DNA连接酶连接 。
  5. 把连接好的重组载体转化入感受态细胞(细菌:E.coli,真菌:Yeast,昆虫细胞或哺乳动物细胞)。
  6. 在不同层次上、不同水平上使用各种方法进行筛选,将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如:载体大小,酶切结果,筛选标记等。
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